糖基转移酶工程菌催化井冈羟胺A糖基化的条件优化及其酶学性质研究

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井冈霉素发酵生产过程中,前体井冈羟胺A会大量积累,极大的影响了产品质量。为了提高产品质量,实验室已成功构建了糖基转移酶工程菌并初步应用于生物转化井冈羟胺A糖基化生成井冈霉素A,但转化效率并不高。为了解决上述问题,本研究将利用镍柱层析分离该糖基转移酶并研究其酶学性质;基于酶学性质的研究结果进一步对全细胞催化井冈羟胺A糖基化的外部条件进行优化;另一方面通过基因工程手段强化糖基供体UDPG合成代谢,以增加催化过程中UDPG的供应,从而解决催化过程中出现的辅助底物不足等问题。实验发现镍柱层析能快速有效的分离该酶,该酶在30℃时酶活最高但酶的温度稳定性不好。相反,酶的pH稳定性较高,酶最适pH在8~9之间。K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+对酶反应有较强的促进作用。通过对酶反应动力学的研究发现,该酶对底物井冈羟胺A的亲和性较强,UDPG相对较弱,同时多组实验结果及酶结构特征表明该酶催化机制符合双取代机制模型。通过实验得出全细胞催化井冈羟胺A糖基化最适条件为以50 mM pH 6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为催化溶剂,用于催化的细胞以100 mM乳糖诱导为佳,催化体系中菌体浓度应该控制在0.04~0.08 g/mL之间,井冈霉素A的摩尔收率能达到95%以上,浓度最高达到1386μg/mL。向催化体系中加入10mMMg2+、Mn2+、0.1%Tween-80能加速催化过程,缩短催化时间。在催化过程中发现,影响催化效率的另一个因素可能是胞内糖基供体UDPG合成量,于是拟通过基因工程手段加强UDPG的合成代谢。从JM109基因组中克隆出UDPG合成代谢关键酶(UDP-葡萄糖焦磷酸化酶)基因,并通过串联的方式成功构建了糖基转移酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶共表达工程菌,命名为pET28-valG-galU BL21(DE3)。该工程菌胞内UDPG的合成量比出发菌株pET28-valG BL21(DE3)提高1.36倍,一定程度上解决了催化过程中出现的UDPG供应不足问题。本研究为解决抗生素生产过程中前体积累问题提供了新的思路。另一方面也为进一步开发糖基转移酶在抗生素等活性分子糖基化修饰的应用提供了理论基础。
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